骨平衡由成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡来维持。这一过程的失调会导致多种疾病，包括骨质疏松症。然而，其潜在的分子机制并不完全清楚。

今年四月国家蛋白质中心在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了名为OTUB1 promotes osteoblastic bone formation through stabilizing FGFR2的文章。在这里，研究人员发现去泛素化酶 OTUB1的全局性和条件性成骨细胞敲除会导致低骨量和低骨强度；在骨关节注射AAV9-FGFR2会挽救因为OUTB1缺乏导致的骨量损失。总而言之，OTUB1 在骨稳态中积极调控成骨分化和矿化。为缓解骨质疏松症提供了一种光学治疗策略。

研究结果

1. OTUB1 缺乏会导致成骨缺陷

通过对OTUB1基因敲除的小鼠进行胚胎期的表型分析，结果表明OTUB1基因敲除的小鼠体长明显下降。为了进一步证实成骨细胞受到了OTUB1的特异性的影响，研究人员进一步检测了胚胎发育E18.5时期基因敲除小鼠的软骨细胞和破骨细胞的生成，结果表明，OTUB1敲除对破骨细胞没有影响，主要是由于成骨细胞的缺陷造成的。为了进一步研究OTUB1在成骨细胞中的作用，利用质谱分析发现在OTUB1基因全基因敲除小鼠中观察到的骨形成延迟主要是由于成骨细胞分化和矿化的缺陷造成的。

图1. OTUB1缺乏会导致成骨缺陷

2. OTUB1通过抑制多泛素链的降解来稳定FGFR2

为了研究OTUB1在调控成骨过程中的潜在机制，首先对OTUB1敲除的小鼠的颅骨的成骨细胞进行RNA-seq分析，发现了一些差异基因。接下来作者利用这些差异基因进行进一步的GO分析。通过KEGG通路分析显示PI3K-Akt和MAPK信号通过是其中最重要的两个通路。接下来研究人员发现OTUB1缺失的细胞中FGFR（表皮生长因子受体）2的蛋白表达，但是并不影响它的转录情况。OTUB1敲除的小鼠中pSMAD2/3、pSMAD1/5、SMAD1 和 SMAD2/3 蛋白的表达没有变化。表明OTUB1缺失不会影响成骨细胞发育过程中SMAD2/3和SMAD1/5信号传导。和对照组相比，KO组的成骨细胞中检测出FGFR2的泛素化增强。进一步揭示OTUB1介导的FGFR2的调控机制，通过突变E2发现，OTUB1通过抑制E2功能来调节FGFR2的非典型机制。

图2.OTUB1通过抑制降解性多泛素链稳定FGFR2

3. OTUB1和SMURF1结合调节FGFR2的泛素化和稳定性

为了确定与 OTUB1 合作调控 FGFR2 泛素化的新的潜在 E3 连接酶，研究人员查询了 FGFR2 的泛素化和稳定性。在UbiBrowser 中将 FGFR2 作为底物进行了查询，查询结果中神经元表达的下调因子（NEDD）4作为候选的目标。在NEDD4的家族里发现只有Smad泛素化调节因子1（SMURF1）和FGFR2又特异性的相互作用。内源性的FGFR2在成骨细胞（OB）和HEK293细胞中和SMURF1相互作用。接下来通过一系列的免疫印迹实验，证明了OTUB1减少了SMURF1介导的FGFR2泛素化依赖于 D88 残基（E2 结合的典型位点）。过量表达 OTUB1抑制了 SMURF1 与 E2 UbcH5C 的相互作用，但对 SMURF1 与其底物 FGFR2 的相互作用没有影响。这些数据表明，OTUB1-E2相互作用破坏了 E3-E2 相互作用，从而抑制了 FGFR2的泛素化。

图3.OTUB1与SMURF1相互作用调节FGFR2的泛素化和稳定性

4. 表皮生长因子受体 2（FGFR2）可挽救 OTUB1 缺失诱导的骨质流失和成骨缺陷

接下来作者利用AAV来进一步验证FGFR2是否是OTUB1在骨骼中的真正的生理靶点，将 AAV9 运载的 FGFR2 注射到两个月大的 OTUB1 小鼠的膝关节中。注射两个月后，使用 IVIS 光学成像和 qPCR 检测了 AAV9 释放 FGFR2 的效率。OTUB1 CKO 小鼠股骨骨质减少的情况在注射 AAV9-FGFR2 后，小鼠股骨骨量下降的情况得到了很大程度的恢复。同时，qPCR 分析表明，OTUB1-CKO 胫骨中 Osx 和 Ocn 等成骨标志物的表达减少在给予 FGFR2 后恢复正常。相反，破骨标志物凝血酶 K（Ctsk）的表达在 OTUB1-CKO 和 FGFR2 的作用下保持不变。这些结果表明，FGFR2 是 OTUB1-缺陷小鼠的成骨过程中不可或缺。

图4.FGFR2能挽救OTUB1缺失导致的骨量丢失和成骨缺陷

5. 过表达OTUB1可减轻OVX小鼠的骨质疏松症

OTUB1 在成骨过程中的积极作用表明，它有可能通过上调成骨过程在骨质疏松症中的应用。基于此，研究人员通过卵巢切除术（OVX）建立了骨质疏松症小鼠模型，发现来自OVX小鼠的 BMSCs 中的mRNA 水平明显降低。此外，在老年骨组织中，OTUB1的mRNA水平也明显降低。于是研究人员提出疑问:是否外源表达OTUB1能否缓解OVX小鼠体内的骨质疏松症？作者将AAV9运载的OTUB1注射到OVX小鼠的膝关节中。手术两个月后在 AAV9-OTUB1处理过的OVX小鼠的股骨中观察到了GFP信号。OTUB1处理的OVX小鼠的胫骨最大载荷和刚度与OVX 组相比明显恢复。同时，经AAV9-OTUB1处理的OVX小鼠的骨量也得到了显著恢复，BMD、BV/TV和 Tb.N 均有所增加。此外，OVX小鼠胫骨中Osx和Ocn等成骨标志物的表达随着 OTUB1过表达增加，而破骨标志物 Ctsk在OVX组和OTUB1处理的OVX组中表达相当。这些结果表明，在膝关节中过表达OTUB1通过促进骨生成缓解了OVX小鼠的骨质疏松症。

图5.过表达OTUB1可减轻OVX小鼠的骨质疏松症

综上，本研究证明了OTUB1在成骨中的关键作用。这篇文献揭示了 OTUB1 与 Smurf1 之间的关系，通过特异性编辑 FGFR2 的泛素化来调控成骨。过度泛素化导致 FGFR2 蛋白水平降低，并损害下游信号传导、 最终导致缺乏 Otub1 的小鼠出现骨质疏松症。通过重新表达表皮生长因子受体 2 可部分缓解这种症状。此外，OTUB1 作为成骨的正向调节因子，在骨质疏松症小鼠模型中防止骨质流失,通过卵巢切除术建立的骨质疏松症小鼠模型。这篇文献为 OTUB1 在成骨过程中的生理功能提供了新的见解，并表明针对成骨细胞的特异性OTUB1作为骨质疏松症的一种潜在治疗策略。

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吉凯助力

该研究中AAV9-FGFR2、AAV9-OTUB1由吉凯基因提供。