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Southern Blot 实验指南

作者:上海书俊仪器设备有限公司 2019-02-27T00:00 (访问量:3500)

 Southern Blot 实验指南

基本概念

   原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到**纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNARNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。 
  用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态如是否有点突变、扩增重排等。

 

 

实验步骤

一、基因组DNA的制备

二、基因组DNA的限制酶切

根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μgDNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg DNA。消化的DNA浓度不宜太高,以0.5μg /μl 为好。具体操作如下:在1.5ml离心管中依次加入

DNA1μg /μl-------------------------------20 μg
10×酶切buffer --------------------------------4.0 μl
限制性内切酶10U/μl------------------5.0 μl
ddH2----------------------500 μl

在最适温度下消化1-3Hour。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。若消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6 Hour已没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解。

如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化;如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。

三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广(200bp-50kb),实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

表:不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

琼脂糖凝胶浓度(%)

分离DN**段范围(kb)表

不同浓度琼脂糖凝胶分离DN**段的范围

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

 

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